Hasta los 12 años de edad, Isabel, hija del segundo matrimonio del rey castellano, ocupa el primer lugar de la línea sucesoria, después de su hermanastro Enrique IV; se ve relegada en 1453 al nacer su hermano Alfonso, preferido por el varón; y es desplazada aún más, como heredera, cuando en 1462 nace Juana, la hija de Enrique IV.

La línea sucesoria se altera cuando una parte de la nobleza castellana sublevada contra Enrique IV, le destrona en la Farsa de Ávila y ofrece el trono a Alfonso, hermano de Isabel, que reinará desde 1465 hasta su muerte en Casdeñosa (Ávila) en el año 1468. Ahora Isabel tiene más posibilidades de ser reina de Castilla, si los nobles que siguen su partido se imponen a los que defienden los derechos de Juana. El triunfo de sus partidarios hará que Isabel sea nombrada princesa primera legítima heredera de la Corona de Castilla en el Convenio o Pacto celebrado en la Venta de los Toros de Guisaldo, término de El Tiemblo (Ávila).

El 24 de agosto de 1468, los personajes principales de la Corte de Enrique IV de Castilla, "El impotente", tuvieron noticia de que el Rey había firmado la víspera o la antevíspera un documento por el que reconocía como su legítima heredera y sucesora a su hermana Isabel.

A los 17 años, Isabel había vivido lo bastante como para tener claro el sentido de su existencia. Cuando aquel 24 de agosto la adolescente rubia, de piel muy blanca y ojos azules, herencia de los Lancaster, esperaba en Cebreros el documento que su hermano Enrique había firmado a pocas leguas, en Cadalso de los Vidrios, reconociéndola como Princesa de Asturias y heredera del trono, tenía ya la misma contextura física, espiritual y política de su madurez. Sabía lo que quería y, sobre todo, lo que no quería, que era precisamente lo que estaba bien a la vista en Castilla. Isabel se hizo mayor a golpe de zozobras y desventuras.

Pero aquella muchacha inteligente, hermosa según los gustos de la época, piadosa y retraída, parecía abocada a un destino poco halagüeño. La degradación de la Corte y los escándalos de Enrique; el menosprecio de éste a su madre; la soledad; la falta de recursos, lindante con la escasez, que madre e hija padecieron; la sombra de un matrimonio forzado, del que se había librado poco antes por la súbita muerte del maestre de Calatrava, viejo rijoso al que la había prometido Enrique IV para asegurarse el apoyo de su hermano el marqués de Villena, y el peligro que corría su vida en aquel baile de golpes de mano, cambio de herederos, raptos y asesinatos, la hicieron madurar a la fuerza.

También la hicieron extremadamente cautelosa, aunque no medrosa. Cuando tuvo ocasión de acceder al poder y de ejercerlo, nunca dudó. Pero no había en ella improvisación sino reflexión acorde con las circunstancias. Y por cierto, que desde aquel 19 de septiembre de 1468, cuando fue jurada Princesa de Castilla en la venta de los Toros de Guisando, no faltaron circunstancias para poner a prueba el ánimo más esforzado. Eso mismo pidió la víspera en la capilla: "Seso y esfuerzo" para defender su derecho. Nunca le faltaron.

En marzo de 1468, Gonzalo Chacón tomo posesión de Medina del Campo en nombre de Isabel, quien en mayo expreso su deseo de visitar la feria de Medina del Campo siendo acompañada por su hermano Alfonso cabalgando junto a ella.

El 4 de julio, mientras Alfonso agonizaba, salió de Cardeñosa una carta firmada por Isabel dirigida al reino donde se decía que si Alfonso moría Isabel era su legítima heredera, que la ciudad sería ocupada en su nombre como su señora natural, y sus diputados se dispondrían a prestarle juramento en las cortes. Cuatro días después, Isabel firmó otra carta en la que anunciaba que Alfonso había muerto el 5 de julio: "a ora de terçia plego a Nuestro Señor que los pecados de estos regnos llevar desta presente vida al dicho señor rey mi hermano".

No hay modo de saber como se sentía Isabel en ese momento. Parece ser que habló de fundar un convento dedicado a la memoria de su hermano en el lugar donde había muerto. Aunque nunca lo hizo, mandó esculpir su figura en un nicho junto a la tumba de sus padres en la Cartuja de Miraflores.

Isabel no estuvo presente cuando enterraron a Alfonso, la noche de su muerte, en el convento de San Francisco de Arévalo. Carrillo y Pacheco la habían llevado a Ávila donde discutieron que medidas adoptar para Isabel tras el fallecimiento de su hermano. Pacheco insistía en que Isabel debía declararse heredera no de Alfonso sino de Enrique, no reina, sino princesa. Carrillo quería que se proclamara inmediatamente reina y sucesora de Alfonso, pues no se fiaba de Enrique: ¿acaso no la había puesto éste bajo la custodia de su esposa para que creciera incapaz de gobernar? Pacheco pensaba que Isabel debía casarse con Alfonso de Portugal. Carrillo por el contrario, consideraba que debía contraer matrimonio con Fernando de Aragón. Llegados a este punto, Pacheco amenazó con llevarse a Isabel de Ávila. Carrillo replicó con firmeza que el otro no se atrevería, porque la guarnición era suya. Pacheco alegó entonces la amenaza de la peste. Carrillo le aseguró que solo atacaba a los varones.

Al morir su hermano Alfonso, había recibido ya la oferta dematrimonio de Fernando de Aragón, pero no aceptó hasta ser jurada como princesa y sucesora. Sin embargo, apenas se perfiló la boda, muchos nobles castellanos y el rey Alfonso de Portugal, tío de Isabel, trataron de desbaratarla a toda costa. Existía el peligro de la creación de un poder hegemónico en la Península que acabara con el precario equilibrio de los tres reinos y con la abundosa cosecha para los nobles del desgobierno de Castilla.

Un factor decisivo para el triunfo de Isabel fue su alianza con Aragón y el matrimonio en 1469 con Fernando, heredero de dicha Corona. La comunidad de intereses refuerza el matrimonio de los que conocemos como los Reyes Católicos, reyes de Castilla a la muerte de Enrique IV en 1474, y de Aragón en 1479.